Suelen alcanzar la madurez sexual a los doce meses, y los sistemas de apareamiento varían de una especie a otra. Algunos murciélagos tienen un comportamiento promiscuo y se unen en grupos numerosos en uno o varios árboles y copulan con varios compañeros cercanos. Muchos microquirópteros neotropicales mantienen y defienden pequeños «harenes» de hembras. Aunque la mayoría de las especies son poliginias o promiscuas, algunas, como Vampyrum spectrum,Lavia frons, Hipposideros galeritus, Nycteris hispida y varias del género Kerivoula, son monógamas y, en estos casos, el macho, la hembra y su descendencia viven juntos en grupos familiares y los machos pueden colaborar en la protección y alimentación de los jóvenes. El comportamiento durante el cortejo es complejo en algunas especies, mientras en otras puede ser casi inexistente, llegando al caso de machos de algunas especies que se aparean con hembras en estado de hibernación que apenas reaccionan ante la cópula.
Un gran número de especies se reproduce estacionalmente; las de zonas templadas a menudo lo hacen antes de iniciar la hibernación. Todas las especies que no son criadoras estacionales se dan en la zona tropical, donde los recursos son a menudo relativamente constantes todo el año. La función de la cría estacional es coordinar la reproducción con la disponibilidad de recursos que permita la supervivencia de los recién nacidos. Los murciélagos vampiro pueden nacer en cualquier época del año.
Los murciélagos son vivíparos, por lo general con un desarrollo embrionario relativamente lento (3-6 meses), la duración de la gestación puede variar según la disponibilidad de alimentos y el clima, y de unas especies a otras puede variar desde los cuarenta días hasta los diez meses. Muchas especies han desarrollado una compleja fisiología reproductiva, como la ovulación retrasada, la implantación diferida, el almacenaje de esperma, el retraso de la fertilización o la diapausa embrionaria. La ovulación retrasada se da fundamentalmente en los murciélagos de zonas templadas, e implica que se apareen a finales del otoño y que la hembra almacene el semen durante todo el invierno; la ovulación se produce en primavera para que las crías nazcan en verano, cuando hay muchos insectos disponibles. En el caso de la implantación diferida el embrión empieza a desarrollarse inmediatamente pero se detiene poco después, esperando a que las condiciones vuelvan a ser favorables; este tipo de embriogénesis se produce en los megaquirópteros africanos y en el género Miniopterus y en otras especies, como Macrotus californicus, el óvulo se implanta pero el feto no se desarrolla hasta la primavera. También pueden alargar la gestación para evitar el mal tiempo; en zonas tropicales, lo pueden hacer para esperar una época mejor en términos meteorológicos o de disponibilidad de alimento. La migración y la hibernación también limitan la temporada óptima de apareamiento.
Al nacer ya tienen entre el 10 y el 30% del peso de sus madres, que necesitan de un gran aporte energético para producir leche para sus crías. Los recién nacidos son completamente dependientes de sus madres tanto para su protección como para su alimento, incluso hasta en el caso de los pteropódidos, cuyas crías ya nacen con piel peluda y con los ojos abiertos; los microquirópteros tienden a ser más altriciales al nacer. En algunas especies las crías nacen estando la madre colgada patas arriba y en otras vuelve la cabeza hacia arriba y recoge la cría con la membrana interfemoral (membrana cutánea que se extiende entre los miembros inferiores y la cola). En la mayoría de las especies las hembras disponen de dos mamas en el pecho, en algunas disponen de otro par de falsas mamas inguinales que sirven para que la cría se agarre y en otras, como en Lasiurus, hay cuatro mamas funcionales; la lactancia puede empezar a los pocos minutos de nacer.
Las hembras generalmente dan a luz a una cría por camada (aunque a veces pueden ser dos) y una camada por año, sin embargo algunas especies del género Lasiurus, como el murciélago boreal rojizo (L. borealis) de América del Norte, pueden llegar a tener tres o cuatro crías. En el norte de Europa los pipistrelos tienen una cría, pero en zonas más meridionales suelen tener dos, y teniendo en cuenta que los gemelos son más frecuentes entre ejemplares en cautividad, bien alimentados, que entre las mismas especies en estado silvestre, probablemente una mejor nutrición influya en el número de nacimientos.
Las especies de zonas templadas forman generalmente colonias de maternidad, una especie de guarderías integradas casi exclusivamente por hembras adultas; estos hacinamientos reducen la pérdida de calor y el gasto energético de cada individuo. La mayoría de los murciélagos, sobre todos los insectívoros, que necesitan de la máxima maniobrabilidad posible, dejan a sus crías en las perchas mientras se alimentan y generalmente sólo las llevan encima cuando cambian de percha. Los jóvenes de especies pequeñas se desarrollan con rapidez y vuelan a los 20 días, en cambio los zorros voladores, de mayor tamaño, pueden tardar tres meses en iniciar su primer vuelo; los vampiros son los que se desarrollan más lentamente, y se amamantan hasta los nueve meses. Aunque generalmente alcanzan su peso corporal máximo pocas semanas después del destete, algunas especies pueden tardar varios años en conseguirlo.
La longevidad media de los murciélagos suele ser de cuatro o cinco años, aunque a menudo alcanzan diez y hasta veinticinco años, y algunas especies pueden llegar a vivir treinta años de edad. La longevidad de los mamíferos generalmente está en relación con su tamaño, por lo que la vida de los murciélagos es sorprendentemente alta en proporción a su tamaño y por lo general es unas tres veces y media más larga que la de otros mamíferos de un tamaño similar
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